論文解讀--鰤魚諾卡氏菌對雜交鱧免疫相關基因表達的影響 |
| 出處：水生動物健康評估公眾號 作者：陳建林 水產養殖網 2019-07-22 11:27:00 |
相關研究表明，當今水產養殖快速發展面臨最大的障礙是由病原體感染誘發的各種魚類疾病。目前，魚類免疫防御病原體感染的分子機制已成為免疫學研究的熱門領域。宿主識別外界病原菌入侵的機制在防御病原微生物感染的過程中發揮重要的作用；病原的識別激活機體特異性和非特異性免疫應答，從而快速消滅入侵的病原菌。因此，轉錄組測序分析有助于揭示鰤魚諾卡氏菌（Nocardiaseriolae）感染雜交鱧（Channa maculata ♀ × Channa argus ♂）后機體中參與特異性和非特異性免疫應答的免疫相關基因表達情況。
此研究通過腹腔注射100 μL 1.0 × 109 CFU·mL-1鰤魚諾卡氏菌刺激雜交鱧48 h，分離雜交鱧血液淋巴細胞進行轉錄組測序分析，探究鰤魚諾卡氏菌刺激雜交鱧免疫相關基因表達影響，對差異表達的免疫相關基因進行篩選與分析，為進一步了解鰤魚諾卡氏菌致病機制與雜交鱧防御機理奠定基礎。主要的研究結果如下：
1、測序數據和質量評估
利用Illumina平臺進行測序，N. seriolaestrain ZJ0503刺激組（Ns組）與PBS對照組（Ctr組）分別獲得了49839332 和 50059283條Raw reads；過濾后分別得到了49759366 和49981784 條Clean reads，其中Clean reads占Raw reads的比列分別為99.84%和99.85%。對兩組測序樣本可信度分析顯示Clean reads GC（%）平均含量47.33%和46.04%；Q20平均值為94.24%和94.32%。Q20表示轉錄組測序錯誤率分別為1%，用于評價轉錄組測序數據質量的好壞程度。一般來說測序質量會隨著Reads的增長而下降，Reads的Q20高于設定的閾值，Reads質量更可靠（表1）。所有原始數據已上傳至NCBI，登錄號為SRP144407。
表1Clean reads的質量分析
2、差異表達基因分析
一共檢查到的表達基因為17196條，其中注釋基因12999條，差異表達基因(Differentiallyexpressed genes (DEGs))共2892條，包括上調基因1387條和下調基因1505條（圖1）。
圖1 N. seriolae刺激組（Ns組）與PBS對照組（Ctr組）間的差異表達基因火山圖
X軸：Ns與Ctr組的表達量變化；Y軸：差異表達基因（DEGs）統計學顯著性分析；藍點：無顯著差異表達的基因；紅點：顯著上調表達的基因；綠點：顯著下調表達的基因。
3、GO功能注釋
轉錄組測序分析獲得所有的DEGs均聚類到三種Gene Ontology (GO)功能注釋類型，其中包括生物進程（BP）、分子功能（MF）和細胞組成（CC）（如圖2所示）。此外，在所有的差異表達基因中，下調基因的數量多于上調基因；而在參與免疫相關的差異表達基因部分（如：Immune response, Immune system process, Antigenprocessing and presentation, Cytokine receptor activity, MHC class I proteincomplex, MHC class II protein complex和MHC protein complex），上調基因的數量多于下調基因。
圖2 差異表達基因進行Gene Ontology（GO）功能注釋
X軸：差異表達基因數；Y軸：GO功能注釋類型，包括生物進化（BP）、分子功能（MF）和細胞組成（CC）類型；紅色條形：上調基因；綠色條形：下調基因。
4、KEGG通路富集
其中的2502條DEGs分別富集于246條Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)通路，富集的前20條通路如圖3所示。此外，在246條KEGG通路數據中，檢測出與免疫相關通路具有14條（表2）。
圖3 差異表達基因（DEGs）富集的前20條KEGG通路
X軸：通路的富集系數；Y軸：KEGG通路類型；富集系數表示在通路中差異表達基因（DEGs）與所有基因的比例，數量20-100的基因用不同大小的點表示，q閾值用不同的顏色表示。
表2 免疫相關通路分析
5、 qRT-PCR驗證
根據轉錄組測序分析反饋數據，隨機挑選16條基因進行qRT-PCR驗證。結果顯示，qRT-PCR驗證隨機挑選的16條基因的表達趨勢與RNA-seq一致，如圖4所示，表明此轉錄組測序分析數據具有較高的可信度。
圖4RNA-seq與qRT-PCR分析差異表達基因（DEG）變化趨勢比較
6、小結
鰤魚諾卡氏菌刺激組（Ns組）與PBS對照組（Ctr組）分別組裝了49839332 和50059283條raw reads，過濾后的clean reads分別占75.50% 和74.25%。差異表達基因一共2892條，其中上調表達基因占1387條，下調表達基因占1505條。對差異表達基因進行GO與KEGG通路富集分析，獲得功能注釋的差異表達基因具有2502條，分布于246條通路中。對富集于前20 KEGG通路中的免疫相關基因進行篩選與比較分析。隨機挑選16個顯著性差異表達的免疫相關基因進行qRT-PCR驗證，驗證結果與測序的變化趨勢一致，表明轉錄組測序結果具有較高的可靠性。該研究為進一步了解鰤魚諾卡氏菌的致病機理與雜交鱧的免疫防御機制奠定了基礎。
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