摘要:運用AQUARE SP間歇流水式呼吸儀,研究了在不同濃度氨氮急性脅迫下,卵形鯧鲹呼吸代謝的變化。試驗設T0(對照)、T1、T2、T3四個組,各組平均氨氮濃度(TAN)分別為0.08、1.07、1.98、3.07mg/L(非離子氨NH3-N:0.00、0.05、0.09、0.15 mg/L)。結果表明:隨氨氮濃度升高,卵形鯧鲹耗氧率(MO2)和代謝率(REO)先上升后達到穩定,而血氨(PA)及氧氮比(O:N ratio)則持續上升,T2、T3組的上述指標顯著高于對照組(P<0.05);肝糖原(LG)呈下降趨勢,從T1組開始就與對照組有顯著差異(P<0.05),而排氨率(RN)、氨商(AQ)、蛋白質供能比(PEP)則在氨氮超過1.07 mg/L后呈下降趨勢,其中T2、T3組顯著低于對照組(P<0.05);肝乳酸(LD)無明顯變化趨勢;相關性回歸分析結果表明除LD外,其它呼吸代謝指標與氨氮濃度相關性較高。結論:在本試驗所設定的條件下,0.08~3.07mg/L氨氮濃度(NH3-N,0.00~0.15mg/L)沒有對卵形鯧鲹產生明顯毒性作用,在此氨氮范圍內,卵形鯧鲹主要以蛋白質和脂肪供能。隨著氨氮濃度升高,卵形鯧鲹的MO2,REO和PA上升,而RN降低,蛋白質供能比例降低,脂肪和糖類上升,增加的糖類能量主要用于大腦和鰓等應對氨氮脅迫的能耗需要。
關鍵詞:卵形鯧鲹;氨氮;耗氧率;排氨率;能源物質;間歇性流水式呼吸儀
1、引言
呼吸和排泄是魚類新陳代謝活動的重要表征,直接或間接地反映魚類代謝的水平、活動規律、生理狀況、能量需求以及維持最低代謝水平的需氧量等,能體現魚類與外界環境因子的相互關系。因此研究魚類的呼吸和排泄,對于了解魚類代謝生理特點和開展魚類養殖均有非常重要的意義。在魚類養殖水體中,氨氮會大量消耗水體溶氧,影響魚類鰓的氧傳遞和正常的呼吸代謝,延緩魚類生長,對魚體生理活動等造成嚴重影響甚至導致死亡[1-3]。氨氮在水中有以下平衡:NH3+H3O+⇌NH4++H2O。當水溫越高、pH越大,NH3存在比例越大[4]。由于NH3能溶于水,不帶電荷,具有較強的脂溶性,幾乎能夠迅速穿透所有細胞膜;水體pH值和氨氮濃度較高時,NH3會抑制生物的排氨,使血液和組織中NH3濃度升高,導致體內NH3積累而中毒[5-6],造成體內正常代謝減慢或停滯[2,7-8],其急性毒性主要表現在對中心神經元的損害[9]。隨著研究的深入,魚類NH3解毒的途徑也逐漸顯明。主要有:1.將NH3轉化為低毒物質谷氨酰胺和尿素:當魚體內因氨氮過高產生過多有毒谷氨酸時,腦組織會激活大量谷氨酰胺合成酶將谷氨酸和NH4+轉化為無毒的谷氨酰胺保護機體免受損傷[10-11]。2.通過收縮或調整鰓的表面積及皮膚對NH3的通透性,來維持并增加氨的排泄,使體內氨氮水平保持在穩定可耐受狀態[12-13]。3.通過減少蛋白質和氨基酸的分解,降低體內氨的產生[14]。4.增加鰓的CO2排泄,酸化魚鰓周圍水體,使水中NH3更多轉化為NH4+而加強魚體內NH3的排泄[15]。5.通過鰓上皮細胞中氯細胞的頂膜與水中的H+或Na+進行交換主動排泄NH4+[16]。 卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)屬鱸形目(Perciformes)鲹科(Carangidae)鯧鲹屬(Trachinotus),俗稱金鯧、黃臘鯧等,為暖水性魚類。近年來,隨著人工育苗的成功和養殖技術日趨成熟,卵形鯧鲹已成為海水魚類養殖的主要品種之一[17],其養殖面積和產量逐年增加,造成的養殖自污染也日益嚴重,特別是養殖水體的氨氮污染對其產業發展有重要影響。每年夏季我國沿海魚蝦養殖基地由于氨氮污染引起魚蝦大量缺氧死亡造成的損失十分嚴重[18],池塘養殖中發病池塘的非離子氨濃度高于未發病池塘,是誘發魚病的主要環境因子之一[19]。目前,關于氨氮對卵形鯧鲹呼吸代謝影響的研究還未見報道,本文研究了不同濃度氨氮急性脅迫對卵形鯧鲹耗氧、排氨及血氨、肝糖原和肝乳酸等指標的影響,為氨氮對卵形鯧鲹的毒理學研究提供基礎資料,并為其健康養殖提供科學依據。
2、材料與方法
2.1試驗用魚及養殖系統
試驗魚為廣東海洋大學龍海天種苗繁育基地自繁自育的卵形鯧鲹,運回實驗室后經消毒處理放入養殖水槽內暫養7d,每天換水1次,換水量為一半。暫養期間,投喂恒興浮性海水魚人工配合飼料4號料,每天2次,投喂后及時用虹吸管法清理糞便和殘餌。養殖試驗在廣東海洋大學魚類種子工程與增養殖實驗室的全自動循環水養殖系統進行,水槽規格:75*45*45cm。試驗用水以經沙濾及300目網濾的天然海水與曝氣3d以上的自來水調配而成,暫養期間水溫(21±1.0)℃,鹽度18~20,pH值7.9~8.1,DO>5.5 mg/L,總氨氮(TAN)<0.09mg/L,NO2-N<0.03mg/L,自然光照。TAN使用Test Kits氨氮測試盒(默克公司,原理:水楊酸分光光度法)、NO2-N用萘乙二胺分光光度法測定。
2.2 呼吸試驗裝置
所用測定裝置是間歇性流水式呼吸儀(Canada,AQUARE SP,下文簡稱呼吸儀)(圖1和圖2)。此套系統一個完整的自動測試過程包括測量、水體交換和等待三個階段。在測量階段,呼吸測量室完全封閉,測量時間可根據實際需要調節,通常最長以水中溶氧量下降不大于呼吸前溶氧量的10%為基礎。測量階段結束接著水體交換階段啟動,以新水更換呼吸室內舊水。接著是短暫的滯后等待階段。如此往復,實現長時間實時監測。
圖1 呼吸測定原理結構示意圖圖2 AQUARE SP呼吸儀原理結構圖
A.呼吸室B.循環泵C.沖水泵 D.數據采集儀  E.計算機  F.氧探頭G.溫度探頭  H.止水開關 I.采水瓶J.溢水口 K.紫外滅菌燈L.溫控儀 M.充氣泵 N.上位蓄水槽  O.實驗外環境水槽P.生物濾池Q.抽水泵
2.3 呼吸試驗方法
試驗毒物為NH4CI (分析純)經105℃烘干至恒重后配制成10g/L的母液,試驗時按比例稀釋至所需表觀測定濃度。經查閱其它魚類有關的資料[20]和預試驗,試驗設T0(不添加NH4Cl母液,對照組)、T1、T2、T3共4個組,各組試驗期間TAN平均濃度及其它水質參數見表1。試驗前停食24h,取暫養健康魚(平均體重85.87±2.98g,平均體長14.34±0.56cm),隨機分到各組下急性脅迫24h,每組3個平行,每個平行10尾魚。試驗水槽體積152L,試驗用水體積90L。整個脅迫過程正常充氧,不投餌。為保證各試驗組氨氮濃度穩定,每3h用NH4C1母液調節一次濃度,每12 h更換曝氣充足且氨氮濃度相等的試驗用水1次,換水量為100%。脅迫24h后將試驗魚放進養殖條件相同的呼吸室內,穩定適應后進行呼吸測定和水樣采集,將魚放進呼吸室的整個過程不超過3min,且盡量避免使魚反應過激,凡轉移魚時不慎掉落的魚一律舍棄。各組均設1個空白(無魚),每個平行每次均隨機取1尾魚測定,直到取完。耗氧率數據直接由呼吸儀在線測定讀取,每尾試驗魚測定6次取平均值,同時采集相應耗氧測定階段相同次數的水樣,現場測定魚呼吸前后水中TAN含量,取平均值。
呼吸試驗結束后立刻取出試驗魚,尾靜脈采血并解剖取肝胰臟。血液用1.42mg/mLEDTA·Na2抗凝離心(3000rpm,10min)后取血漿,用于血氨(plasma ammonia,PA)測定。肝胰臟剔除脂肪,用預冷生理鹽水沖洗后脫脂棉吸干稱重,-80℃冷凍保存,用于測定肝糖原(liverglycogen,LG)與乳酸(lactic acid,LD)。PA、LG、LD分別用血氨A086測試盒、肝糖元A043測試盒、乳酸(LD) A019-2測試盒(南京建成)測定。
2.4 計算與數據處理
上述各式中,slope是測定期間水中溶解氧曲線斜率;V是呼吸室、循環泵及流通管的總體積(ml);Vf是魚體體積(ml);W是魚體濕重(g);是經魚體呼吸前后的水體中總氨氮的變化量(mg);△t是測定所用時間(h);OC為氧卡系數(13.56J/mgO2);pKa=0.09018+2729.92/T(T為開氏溫度,T=273+T℃) 所得數據均用Excel和SPSS17.0行相關性檢驗、方差分析,組間差異行Duncan多重比較,數據均用平均值±均值標準誤(M±S.E.M.)表示,顯著性水平為P<0.05。
3、結果
3.1 試驗水質參數及卵形鯧鲹中毒癥狀 各實驗組水質參數如表1所示。在24h的脅迫過程中,無試驗魚死亡;T0、T1組的試驗魚未見異常反應,T2、T3組則呈現不同程度呼吸急促反應,體色變淺,體表粘液增多,T3組尤為明顯,但未出現極端掙扎、游竄現象。
表1 各試驗組水質參數
注:所有數據均以M±S.E.M.表示。DO:溶解氧;NH3-N:非離子氨。
3.2不同氨氮水平對卵形鯧鲹呼吸代謝的影響 由表2可知,隨氨氮濃度升高,卵形鯧鲹耗氧率(MO2)和代謝率(REO)是先上升而后達到穩定,而血氨(PA)及氧氮比(O:N ratio)則持續上升,T2、T3組的上述指標均顯著高于對照組和T1組(P<0.05)。隨氨氮濃度升高,肝糖原(LG)呈下降趨勢,從T1組開始就與對照組有顯著差異(P<0.05),而排氨率(RN)、氨商(AQ)、蛋白質供能比(PEP)則在氨氮濃度超過1.07 mg/L后開始呈下降趨勢,其中T2、T3組顯著低于對照組和T1組(P<0.05)。隨氨氮濃度升高,肝乳酸(LD)無明顯變化趨勢,T1組LD比其他各組都高,但只與T3組有顯著性差異(P<0.05);回歸相關分析結果也表明LD與氨氮濃度相關性較低。對NH3-N濃度(x)與各項呼吸代謝測定指標進行回歸分析,得出回歸方程分別如下:MO2= -2.1172x2 + 0.5176x + 0.1607(R2 = 0.8264),RN = -215.69x2 + 8.0356x + 10.948(R2 = 0.9355),RE = -27.797x2 + 6.9451x + 2.1757(R2= 0.8259),AQ = -1.1865x2 - 0.2783x + 0.1551(R2 = 0.9004),PEP = -360.14x2 - 83.155x + 46.884(R2 = 0.8995),O:N = 296.62x2 + 20.828x + 12.857(R2= 0.9446),LG= 341.27x2 - 184.25x + 60.457(R2 = 0.9639),LD= -5.5671x2 + 0.6399x + 0.2641(R2 = 0.6653),PA= 3758.7x2 - 55.505x + 110.8(R2 = 0.9994)。
表2 不同氨氮水平對卵形鯧鲹呼吸代謝的影響
注:所有數據均以M±S.E.M.表示。 
3.3 體內血氨(PA)累積與MO2、RN、PEP、O:N、LG及LD的關系 圖3分別顯示了卵形鯧鲹體內血氨(PA)累積與MO2、RN、PEP、O:N、LG及LD之間的關系。由圖可見,隨著PA不斷累積,MO2先升高后在PA為138.31µmol/L(T2)與185.84µmol/L(T3)處達到穩定并顯著高于對照組(P<0.05),。RN與PEP則在PA超過115.66µmol/L(T1)后迅速顯著下降(P<0.05),而O:N 比的變化趨勢則剛好相反。LG隨PA的累積而迅速降低,一直呈下降趨勢;LD在PA為115.66µmol/L(T1)處比其他各組都高,但此后便恢復到對照組水平附近,回歸相關分析結果也表明LD與血氨累積相關性較低。經回歸相關分析,得出對PA(x)與上述各項呼吸代謝測定指標進行回歸分析,得出回歸方程如下:MO2=-2E-05x2 + 0.0056x - 0.2381(R2 = 0.9996),RN= 0.0002x2 - 0.1213x + 21.676(R2 = 0.9515),PEP = 0.0047x2 - 1.6668x + 173.33(R2 = 0.98),O:N = -0.0015x2 + 0.5681x - 31.86(R2 = 0.987),LG = 0.003x2 - 1.1058x + 143.15(R2 = 0.8388),LD = -1E-06x2 - 0.0001x + 0.3077(R2 = 0.5105)。  
圖3卵形鯧鲹體內PA累積與MO2、RN、PEP、O:N、LG及LD的關系
4、討論
4.1 魚類能量代謝的研究方法
測定魚類的能量代謝常用間接法,主要有靜水式、開放流水式、封閉流水式、間歇流水式四種。靜水式無法保證水中溶氧恒穩,易累積代謝廢物。開放流水式需要修正數據,很難得到正確的研究數據。封閉流水式可控制入水水質,較常用,但其很難排除魚體代謝廢物在水體中的耗氧,不適于飽食狀態下的呼吸測定。間歇流水式測量系統綜合了封閉式和開放式的優點,克服了它們測量時間解析度差和不能連續長時間測量的缺點,使得測定更穩定可靠,為眾多學者所用[24-26],因此本試驗也采用間歇流水式呼吸儀來開展實驗。
4.2氨氮對卵形鯧鲹的毒性興奮效應
在遭受氨氮脅迫時,生物體所作出的呼吸代謝反應因種類、甚至相同種類的不同個體和生長階段都會有不同程度的差別。如阿部鯔蝦虎魚(Mugilogobius abei)在2mmol/LTAN下MO2和RN均顯著低于對照組,特定生長率卻提高了[27]。當在1mmol/L、1.4mmol/L和5mmol/L氨氮中暴露,頭3h內,鯉魚(Cyprinus carpio)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的RN都下降,PA上升,但金魚(Carassiusauratus)卻一直維持在對照組水平附近;到12h時,三種魚類的RN及PA都重新恢復到了對照組水平[12]。在0-10mg/LTAN內,隨TAN升高,中國對蝦(Penaeus chinensis)MO2、尿素氮排泄率及PA不斷增大,RN卻不斷降低[28]。Racotta認為,MO2等指標隨氨氮濃度升高而增大是氨氮在低濃度無毒情況下對機體的刺激現象,是一種“毒物興奮效應”,當氨氮濃度超過可耐受范圍時才會對生物起毒害作用,抑制其各項生理活動[29],如河蚌(Anodontawoodiana)[30]。本試驗中,隨著氨氮濃度的上升,卵形鯧鲹的MO2和REO不斷增大并在氨氮濃度為1.98-3.07mg/L時達到穩定,可見本試驗所設定的氨氮濃度使卵形鯧鲹的呼吸代謝產生了毒物興奮效應。
4.3卵形鯧鲹對氨氮脅迫的適應策略
NH3會抑制生物的氨氮排泄,使PA累積,造成體內正常代謝減慢或停滯[2,5-8]。大量研究表明,PA與環境中氨氮水平成正相關,可用于評估魚體氨中毒的程度[5][31]。在本研究中,氨氮濃度超過1.07mg/L后,試驗魚RN開始顯著降低,PA則顯著升高,且氨氮濃度越高,卵形鯧鲹的氨氮排泄受抑制和PA積累越明顯。在高氨氮環境下,生物體PA及組織氨含量的升高似乎成了魚體應對外界氨氮環境的一種適應,因為這會降低魚體內NH3分壓從而減少其后通過鰓和體表流入體內的外源性氨[32]。然而,有些魚類即使在高氨氮環境下PA也不會變化,如單帶紅脂鯉(Hoplerythrinusunitaeniatus)[33]、非洲肺魚(Protopterus Aethiopicus)[34]??梢姴煌N魚類即使在相同環境氨壓力下,反應也不盡相同,這可能與它們對氨的耐受能力和氨解毒途徑有關。有些魚類會通過減少蛋白質和氨基酸的分解,降低體內氨的產生,從而一方面體現為RN的下降,如虹鱒[14]。本試驗中卵形鯧鲹可能也使用了這條解毒途徑。 魚類對氨的一個重要解毒途徑是在大腦中將谷氨酸轉化為谷氨酰胺,這種轉換需要消耗能量,而硬骨魚類大腦幾乎只能利用葡萄糖作為能源物質[35],水體中的氨氮濃度會改變魚類大腦的能量代謝,引起肝臟LG含量的變化[36]。魚體排氨的另一個重要途徑是鰓的Na+/NH4+離子交換作用,由鰓上皮細胞中的富含線粒體細胞通過各種離子運輸體和酶主動運輸NH4+離子,且消耗大量能量[6,37]。Chang等研究發現,這些能量源自魚鰓富含線粒體細胞中儲存的糖原,當魚體遭遇氨氮脅迫時,鰓中糖原用于鰓維持離子分泌機制最初的能量需要,隨后由肝臟分解糖原提供其后面的能量需要[38]。在本研究中,卵形鯧鲹LG隨氨氮濃度升高而下降,各氨氮處理組LG均顯著低于對照組,可見在此氨氮范圍下,卵形鯧鲹為了應對外界氨氮的脅迫,加強LG的分解,為大腦和鰓提供能量。
乳酸是衡量機體是否發生厭氧代謝的一個重要指標[36]。當氧供應不足或組織無法足夠快處理氧時,機體會通過無氧糖酵解產生大量乳酸[39]。本試驗中,各組LD并無顯著差異,卵形鯧鲹沒有通過增加厭氧代謝來提供能量,這也在一定程度上反應了本試驗所設定的氨氮濃度只是對卵形鯧鲹引起興奮效應,而沒有產生明顯毒性作用。
AQ可直接反映蛋白質代謝供能占總供能的比例[40]。在硬骨魚類中,全部以蛋白質氧化供能時,AQ值為0.33;若AQ高于0.33,說明機體內發生了蛋白質的厭氧分解作用,或者代謝底物的分解發生了轉換;若低于0.33,表明除蛋白質之外的其它底物參與了氧化分解,蛋白質的供能比例下降[41]。理論上,機體若完全以蛋白質為氧化基質供能,O:N比約為7;以蛋白質和脂肪供能時,O:N比為24;O:N超過24時,主要以脂類和糖類氧化供能,而且O:N越大,脂肪或糖類供能比例也越大,完全以脂肪或糖類供能時,O:N比將無窮大[42-44]。本試驗中,氨氮濃度在1.07mg/L以內,卵形鯧鲹AQ、PEP、O:N保持在較穩定水平,PEP約為45%,O:N在13左右,蛋白質是卵形鯧鲹最主要的供能物質。當氨氮濃度超過1.07mg/L后,AQ和PEP均顯著低于對照組,O:Nratio則相反,且氨氮濃度越高,這種變化越顯著;氨氮為1.98mg/L、3.07mg/L時,AQ分別下降了27.3%、40%,O:N分別增大到18和22,PEP所占比例也進一步從45%下降到33%和27%,脂肪所占供能比例不斷增大??梢姳驹囼炏?,卵形鯧鲹的主要能源物質是蛋白質和脂肪,隨著氨氮濃度的增大,其不斷調整體內氧化供能物質的比例,降低對蛋白質的利用。這可能是卵形鯧鲹對遭遇外界非離子氨脅迫時的一種適應策略。
5、結論
在本試驗所設定的條件下,0.08~3.07mg/LTAN濃度(NH3-N,0.00~0.15mg/L)對卵形鯧鲹產生了興奮效應而未見明顯毒性作用,在此氨氮范圍內,卵形鯧鲹主要以蛋白質和脂肪供能。隨氨氮濃度升高,卵形鯧鲹的MO2,REO和PA上升,而RN降低,蛋白質供能比例降低,脂肪和糖類上升,增加的糖類能量主要用于大腦和鰓等應對氨氮脅迫的能耗需要。  
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1、來源:南方水產網、南方水產微信公眾平臺 2、作者:湛江市水產學會 陳剛1,2,3,李金蘭1,張健東1,2,3,黃建盛1,2,3,周暉1,2,3,王忠良1,2,3,湯保貴1,2,3 (1.廣東海洋大學水產學院,湛江 524025;2.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室,湛江 524025;3.廣東省普通高校南海水產經濟動物增養殖重點實驗室,湛江 524025)
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