食品安全時代飼料中抗生素強有力的替代品，為何是它脫穎而出？ |
| 出處：水產前沿 作者： 水產養殖網 2017-07-13 20:26:00 |
抗生素因為食品安全及細菌耐藥性問題，其在飼料中的使用越來越受到限制。短中鏈脂肪酸（C1-C14）及其衍生物（脂肪酸鹽及脂肪酸甘油酯）具有廣泛的抑菌效果及其他營養作用，是抗生素強有力的替代品。脂肪酸及其衍生物在抑菌機理和抑菌效果受到碳原子數量和衍生產物類型的影響，并且其在飼料中的應用受到其它因素（飼料加工、胃腸道消化吸收、腸道內pH等）的影響。短鏈脂肪酸（以丁酸為代表）的抑菌作用、營養作用及其他功能性作用（如免疫、腸道屏障等）研究非常充分，但是其在飼料中的應用卻受到了氣味、加工、動物吸收等等方面的限制。隨即出現了脂肪酸鹽、包被脂肪酸及脂肪酸甘油酯。中鏈脂肪酸碳鏈長度在8到14之間，其抑菌機理與短鏈脂肪酸完全不同。中鏈脂肪酸甘油酯是一種非離子表面活性劑，可以直接穿過細菌細胞膜，并成為細胞膜的一部分，從而改變細胞膜的穿透性；同時抑制細菌中脂肪酶（在細菌定植黏膜細胞表面過程中所必須的）的活性。中鏈脂肪酸及其衍生物抑菌效果高于短鏈和長鏈鏈脂肪酸，其最小抑菌濃度比短鏈脂肪酸可低10倍。此外更有研究表明中鏈脂肪酸甘油酯對病毒有很強的抑制作用。本文綜述了短中鏈脂肪酸及其衍生物的抑菌機理和抑菌效果，以期為養殖業應用此類產品提供使用依據。
文/圖 上海亙泰實業集團 朱滔 黃小燕 王根虎
廣東美瑞科海洋生物科技有限公司 虞予
近年來，脂肪酸及其衍生物的抑菌活性也一直受到人們的關注．已有研究表明，脂肪酸及其衍生物可抑制絲狀真菌以及酵母菌的生長，同時也可抑制細菌的生長繁殖。研究表明脂肪酸及其衍生物對常見致病細菌（鼠傷寒沙門菌、單核增生李斯特菌、副溶血性弧菌）存在抑制作用。脂肪酸根據碳原子的多少分為短鏈脂肪酸、中鏈脂肪酸和長鏈脂肪酸。碳原子數為1-6的脂肪酸成為短鏈脂肪酸，也稱揮發性脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸。碳原子數為8-14的脂肪酸成為中鏈脂肪酸，中鏈脂肪酸包括辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸。短鏈脂肪酸可以被腸道上皮細胞吸收，在腸道中既能作為能量被利用，也能調節腸道菌群平衡。并且短鏈脂肪酸對于維持大腸的正常功能和結腸上皮細胞的形態和功能具有重要作用。中鏈脂肪酸主要存在于椰子油和棕櫚油等植物油中，己酸至癸酸含量在椰子油約為15％。棕櫚油中的辛酸和月桂酸約占55-60％。另外反芻動物乳中含量也高，牛油中含量低于6％。大量研究表明，中鏈脂肪酸可以降低動物消化道和內臟微生物數量以及動物產品受微生物污染的機會。它不僅能夠滅活病菌，還能改變病原體的致病毒性。實驗表明，中鏈脂肪酸有減少梭狀芽胞桿菌和沙門氏菌的毒力，抵抗疾病，減少腸道以及全身病毒的效果。因此本文綜述了短鏈和中鏈脂肪酸及其衍生物的抑菌機理、抑菌活性，為其在動物日糧中的使用提供理論基礎。
1、短鏈脂肪酸
1.1、抑菌機理
游離脂肪酸的一般抗菌活性機理。其中一種廣為認可的假設是短中鏈脂肪酸以它們未解離的形式擴散到細菌細胞原生質內，然后解離，從而導致細胞內酸化(Sun等1998)。較低的細胞內pH可導致細胞內的酶失活(Viegas和Sa-Correia1991)，和氨基酸轉運抑制(Freese等，1973)。
圖1-1非電離有機酸抑菌殺菌機理
在偏酸（pH為3-4）的環境，非電離的有機酸可穿入大部分細菌胞膜，有機酸在胞內電離產生氫離子，而導致胞內pH偏低（Russell和Diez-Gonzalez，1998），影響到細菌內生物大分子的功能。為了維持胞內pH呈中性，細菌必需動用能源ATP來運送氫離子到胞外。但此耗能工作終將導致細菌用盡能源而死亡（Guilloteau等，2010）。而酸根離子則有可能影響到胞核內的基因表達，下調其毒性，如侵入腸膜細胞能力。比利時科學家VanImmerseel等(2006)已證明丁酸對沙門氏菌就具有下調其毒性基因表達的效果，而導致沙門氏菌在腸道內的危害大為減弱。由于有機酸滅菌功能主要來自于非解離分子狀態，而解離程度與環境pH值和其本身的解離常數（pKa），所以有機酸抑菌殺菌的效果受到環境酸堿度及其本身的電離特性（pKa）（表1）的影響。丁酸及丙酸的效率應高于甲酸、乳酸和苯甲酸。有機酸的殺菌作用在偏酸（pH=4）環境較偏堿（pH=7）環境強，在pH=4有機酸多以非電離結構存在，因而易于殺滅有害細菌。
表1，有機酸在家禽消化道的結構式與部位的酸堿度有直接關系
1.2、短鏈脂肪酸抑菌效果
表2列出丙酸及山梨酸在電離或非電離分子時對抑制幾種有害細菌生長所需的最低濃度的比較。電離分子滅菌所需的濃度為非電離分子的11到350倍，因而失去了在飼料加工的實用性。由于有機酸必須在偏酸的環境才有較好的滅菌功能，那么在豬的消化道只有胃的pH接近有機酸最佳的滅菌功能。對飼料到達胃之前的滅菌功能不大。據有機酸的消化試驗報告（Bolton和Dewar,1965），大部分（95-99%）乙酸、丙酸及丁酸都在到達小腸之前被吸收入體內（表6），因而不能對小大腸提供顯著功能。有機酸在胃中作為酸化劑的功能也會因為飼料配方中其他原料的中和能力而降低（表4）。即便是有機酸能過胃而到達小腸，其酸化或滅菌功能也會因腸道分泌大量的中和物（碳酸氫鈣或碳酸氫鈉）被大量削減。試驗指出高劑量添加有機酸（1%）也不能顯著降低盲腸的pH值（表5）。這也說明丁酸、丁酸鈉/鈣鹽或包被丁酸即便是能過胃達到小腸，其功能效率也不顯著。有機酸（如丁酸）應與另一分子結合因而其滅菌功能不受環境pH的限制（即在酸堿環境下，均能有效滅菌）。
表2，非電離或電離有機酸對抑制有害細菌生長的最低濃度
表3，不同有機酸在pH5.2抑制芽孢、大腸桿菌及乳酸菌的最低濃度比較
表4，常用飼料原料在酸性環境（如胃）的中和作用
表5，添加不同劑量的甲酸、丙酸或檸檬酸對41日齡肉雞盲腸pH的影響
GauthierR.,2006.AustralianVeterinaryPoultryAssociationConference
Defoirdt等(2006)報道不同濃度的短鏈脂肪酸例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸(1,10和100mM)在pH6時對坎氏弧菌的生長抑制的影響。他們進一步指出，在濃度為100mM時，所有的短鏈脂肪酸都顯示出對坎氏弧菌生長100%抑制，然而在其他兩個濃度時無效果。根據上述調查結果，Wolin(1969)報道在pH6,10mM的短鏈揮發性脂肪酸部分抑制大腸桿菌的生長。相似地，VanImmerseel等(2003)也報道，在同樣的pH條件下，100mM的短鏈脂肪酸完全抑制腸炎沙門氏菌。
Defoirdt等(2006)報道短鏈脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)對坎氏弧菌的生長抑制作用具有pH依賴性。他們指出pH5，生長被完全抑制，然而在pH6時，生長抑制被推遲，在pH7無抑制效果。本研究結果與Wolin(1969)，McHan和Shotts(1993)和VanImmerseel等(2003)研究在不同pH條件下短鏈脂肪酸對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌生長抑制效果的結果存在相關性。生長抑制效果依賴pH的原因實際上是因為在低pH時，占主導地位的未解離的脂肪酸能通過細胞膜(Sun等1998)。
1.3、短鏈脂肪酸在飼料中應用缺陷
a、短鏈脂肪酸發揮作用需要已未解離形式存在，需要在胃腸道中維持偏酸性環境，但腸道中ph偏中性（見表6）。
b、短鏈脂肪酸在胃腸道前段就已經作為能量物質被吸收，吸收率很高，很難達到腸道后段發揮作用。因此短鏈脂肪酸在胃腸道前段發揮作用，而包被脂肪酸可以控制其釋放位點，從而在腸道后段發揮作用，而這也是有害微生物聚集的位置。
c、短鏈脂肪酸具有異味，添加至飼料中影響適口性
d、短鏈脂肪酸具有腐蝕性，添加至飼料過程中容易腐蝕加工設備
2、短鏈脂肪酸鹽
短鏈脂肪酸具有很多的優點，因其具有游離性和揮發性的缺陷限制了其在飼料中的使用,飼料生產中將其制成相對穩定的鈉鹽,因此脂肪酸鹽進入了畜牧業人員的眼中。
脂肪酸鹽是一種常見的脂肪酸產品形式，但其惡臭氣味給加工者帶來麻煩，更重要的是此類產品把脂肪酸送達到腸道的能力十分有限，有學者報道脂肪酸鹽形式的脂肪酸過胃后，超過99%的脂肪酸在小腸前端被快速吸收(Bolton和Dewar,1965)（如表6）。
1)、大約40%的脂肪酸鹽在禽嗉囊被吸收；
2)、進入胃中，在鹽酸的水解作用下，將脂肪酸鹽分解為游離脂肪酸和氯化物；
3)、游離脂肪酸在小腸前段被吸收，無法到達腸道
表6，有機酸鹽在家禽消化道濃度改變的測定
3、包被脂肪酸及脂肪酸鹽
3.1、使用包被脂肪酸的原因
A、脂肪酸在小腸中很容易被吸收，通過包被可以使脂肪酸到達后腸道，發揮殺菌功能；
B、脂肪酸鹽有特殊的脂臭味，是豬喜歡，人不喜歡，當使用者對脂肪酸鹽氣味不適應時采用包被產品；
C、防止產品受潮。
3.2、包被脂肪酸的材料
A、水溶性壁材包被：如糖漿、乳清粉、殼聚糖
B、脂溶性壁材包被：如棕櫚油硬脂、羥化油脂等
3.3、抑菌效果
注：VanImmerseel等（2004）采用的是包被短鏈脂肪酸（甲酸0.22%、乙酸0.24%、丙酸0.27%用的film-coatedmicrobeads包膜微球，丁酸0.15%用的是spray-cooledmicrocapsules噴霧冷卻微膠囊.），無菌小雞仔5、6日齡攻毒腸炎沙門氏菌5×103cfu，第8日齡盲腸采樣測定沙門氏菌含量。
3.4、缺陷
一些包被基質遇水被分解掉，即在進入動物體內或者剛到達消化道就已經被變為脂肪酸/脂肪酸鹽；脂肪酸鹽在胃中被水解，無法達到腸道，起不到抑菌的作用。
由硬脂酸和棕櫚酸制成的膠囊，其消化率低（SminkW等，2008），仔豬沒有足夠的脂肪酶分解膠囊。脂肪酶僅在十二指腸發揮作用（小腸第一段）
氫化脂質制成的膠囊的消化率（如棕櫚酸、硬脂酸和棕櫚酸/硬脂酸甘油酯制成的膠囊）；熔點，50-60°C。
4、短鏈脂肪酸甘油酯
為了克服脂肪酸、脂肪酸鹽及包被脂肪酸以上的難點，更好地應用脂肪酸，有專家將短鏈脂肪酸與甘油混合制備成短鏈脂肪酸甘油酯，生產應用較多的是丁酸甘油酯。其特點如下：
A、短鏈脂肪酸經過與甘油的共價結合，性質更穩定，不受高溫和pH影響，而且沒有原來的惡臭味道。
B、在腸道中被緩慢釋放，發揮對腸黏膜的功能性作用；
C、具有更強大的殺菌作用
D、全程維護消化道
4.1、抑菌機理
A、通過水脂兩親特性破壞有害菌細胞膜
B、通過水通道蛋白進入細菌細胞
4.2、抑菌效果
短鏈脂肪酸及其甘油酯對一系列病原微生物都有抑制作用，包括包膜病毒、衣原體和細菌（Isaacs等，1995；Petschow等，1996；Bergsson等，1998；Bergsson等，1999）。
據報道，在腸道pH6-7時需要2.8%的純丁酸(28kg/t)殺死54沙門氏菌菌株，如果我們考慮到微膠囊丁酸鈉含24%的丁酸，則需要11.6%的包被丁酸鈉在腸道中起到抗沙門氏菌的作用(116kg/t)，在pH7丁酸甘油酯的最小抑制沙門氏菌的濃度（同樣抑制大腸桿菌O157)為0.06-0.12%。
據報道，脂肪酸甘油一酯的抑菌效果極強如：幽門螺桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球菌和復雜皰疹病毒等，是游離脂肪酸的10倍以上。其抑菌活性不像游離脂肪酸一樣依賴于pH,且極容易被微生物細胞吸收。
在體外培養基及不同pH（4.5/7）環境下，丁酸與丁酸甘油一酯對沙恩數據及梭狀腸炎菌的殺滅功能比較。
5、中鏈脂肪酸及其衍生物
5.1、抑菌機理
盡管脂肪酸甘油酯的抑菌機理還不是非常清楚，但是其中一種比較合理的假設就是，脂肪酸甘油酯，作為一種非離子表面活性劑（Mroz等，2006），穿過細菌細胞膜，并成為細胞膜的一部分，從而改變細胞膜的穿透性（Kollanoor等，2007），同時抑制其中脂肪酶的活性，而脂肪酶對于其在黏膜細胞表面定植是必須的（Isaacs等，1995；Bergsson等，1998,2002）。電鏡研究表明，脂肪酸甘油酯處理細菌時，細菌膜的漿膜溶解，而對細胞壁的肽聚糖無影響。（Bergsson等，1998）。脂肪酸及其甘油酯（如月桂酸甘油酯）在低劑量時會影響細菌信號傳導、抑制毒性因子及耐藥性基因的表達（Projan等，1994；Ruzin和Novick，1998）。除了這些作用外，中鏈脂肪酸甘油酯的還可以激活溶菌酶，也在一定程度上抑制細菌的生長（Tsuchido等，1985）。
5.2、抑菌活性
中鏈脂肪酸甘油酯抑菌活性較其他脂肪酸和衍生物具有更強的抑菌活性。Wang和Johnson（1992）報道，脂肪酸的抗菌作用隨著鏈長度的增加而降低，中鏈脂肪酸的抗菌作用比長鏈脂肪酸更強。Isaacs等（1995）也指出含有8-12個碳的脂肪酸比長鏈脂肪酸的抗病毒和抗菌效果更好。中鏈脂肪酸與長鏈脂肪酸相比，疏水性較低且更易溶，其殺菌效果更好。中鏈脂肪酸對空腸彎曲菌的最小抑菌濃度（Hermans等，2010）比短鏈脂肪酸的最小抑菌濃度（VanDeum等，2008）低10倍以上。Boyen等（2008）年的研究結果類似，他發現中鏈脂肪酸（辛酸和癸酸）比短鏈脂肪酸（甲酸、乙酸、丙酸、丁酸）對54種鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度低8倍，另外一些革蘭氏陰性菌和陽性菌也有同樣的情況（Nakai和Siebert，2003）。VanImmerseel等（2006）更是指出，在對沙門氏菌的抑制效果上，所有脂肪酸中，中鏈脂肪酸可能是最有效果的。此外，許多研究表明辛酸、癸酸和月桂酸的脂肪酸酯比其脂肪酸形式更能抑制細菌（Kabara等，1972；Bergsson等，1998,1999,2002；Petschow等，1998，Sprong等，1999）。
脂肪酸單甘酯，甘油二酯，甘油三酯的最小抑菌圈濃度（Kabara等，1972）
己酸、辛酸、葵酸對空腸彎曲菌的最低抑菌活性在ph6時分別為0.25、0.5、0.5mM，在ph7時分別為4、4、4mM（Hermans等，2010）。研究證明辛酸、辛酸甘油酯和辛酸鹽對一系列細菌都有殺菌作用，包括大腸桿菌（Annamalai等，2004；Amalaradjou等，2006）、阪崎腸桿菌（Nair等，2004）和李斯特菌（Nair等，2005）。
Immanuel等（2011）研究了不同濃度辛酸和不同時間對副溶血性弧菌生長的影響。此研究表明在辛酸在100mM濃度時，5h就100%完全抑制病菌的生長。研究證明辛酸、辛酸甘油酯和辛酸鹽對叉尾鮰愛德華菌、遲緩愛德華氏菌、鏈球菌和魯氏耶爾森菌的最小殺菌量分別為10、5和100mm，10、5和100mm，15、5和75mm（Kollanoor等，2007）。
6、短中鏈脂肪酸甘油酯復合物
7、抑菌功能總結和比較
1.短鏈脂肪酸（乙，丙，?。憾∷峋哂卸喙δ苌?，及抑制細菌生長優勢，但抑制范圍及有效度，及環境應用限制因子（腐蝕性，惡臭，僅在酸性環境有效，水溶性太強極易在動物消化道內被吸收劑代謝）
2.丁酸鈉，包被丁酸鈉：有助消化道發育，但抑制細菌力弱，物化穩定性弱（電子鍵）
3.丁酸甘油酯（一酯）：抑制一般有害細菌力強，也有助消化道發育，其物化穩定性極強（共價鍵）
4.中鏈脂肪酸（C6，C8，C10，C12）：有抑制細菌生長功能
5.包被中鏈脂肪酸及甘油酯（一酯）：強化其抑制細菌功能，但是目前包被的工藝尚不成熟（包被過渡或包被不夠）
6.短中鏈脂肪酸甘油酯（三酯，二酯，一酯）：擴大抑制有害病菌及病毒范圍及有效度
脂肪酸功能總結比較如表所示
結論
抗生素問題是飼料和養殖行業現如今面臨的最大挑戰之一。雖然通過飼養管理措施的改進和添加一些飼料添加劑（氧化鋅、益生菌）可以降低抗生素的使用，但是我們需要更加科學、準確、有效的措施來替代抗生素。短中鏈脂肪酸及其衍生物特制產品是動物機體正常代謝產物，殘留和耐藥風險很小。并且其在抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌時具有獨特優勢，脂肪酸單甘油酯在抑菌效果、抑菌機理、實
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